引物二聚体（pcr引物二聚体特别亮）

　　引物二聚体（pcr引物二聚体特别亮）
　　基本原理
　　聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种体外特定核酸序列扩增技术。模拟DNA的天然复制过程，由变性-复性-延伸三个基本反应步骤构成:根据靶序列DNA片段两端的核苷酸序列,合成两个不同的寡聚核苷酸引物，它们分别与DNA的两条链互补配对。将适量的寡聚核苷酸引物与4种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP) .DNA聚合酶及含有靶序列片段的模板DNA分子混合，经过高温变性(使DNA双链解开)、低温复性（使引物与模板附着)和中温延伸(合成新的DNA片段)三个阶段的一次循环，DNA的量即可以增加1倍，则30次循环后，DNA的量增加230倍。
　　典型的PCR反应体系和PCR的三个阶段
　　典型的PCR反应体系构成：
　　DNA模板
　　反应缓冲液
　　两个合成的DNA引物：dNTP、MgCl2（分别为上游引物和下游引物）
　　耐热Taq DNA聚合酶等
　　PCR的三个阶段如下:
　　模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备;
　　模板DNA与引物的复性:温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
　　引物的延伸:DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶作用下，以4种dNTP为反应原料，靶DNA序列为模板，按碱基配对与半保留复制原则，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-复性-延伸，就可获得更多的半保留复制链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
　　实验用品
　　1.材料
　　枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis AS 1.398基因组DNA溶液
　　2.试剂
　　2×Taq酶PCR反应混合液(含Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、MgCl2、4种dNTP);
　　上游引物、下游引物
　　石蜡油;
　　琼脂糖;
　　10×TBE电泳缓冲液:称取Tris108g，硼酸55g,Na2EDTA7.44g，双蒸水定容至1000mL;
　　6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝，40%(w/v)蔗糖水溶液;
　　EB溶液母液:将EB配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹;
　　DNA纯化试剂盒
　　DL2000TM DNA Marker
　　3.仪器
　　超净工作台
　　高压灭菌锅
　　高速离心机
　　移液枪
　　PCR扩增仪
　　水平电泳槽
　　电泳仪电源
　　凝胶成像系统
　　电炉
　　实验步骤
　　引物设计
　　在NCBI上查询Bacillus subtilis alkaline phosphatase (ALP)的基因序列，以Bacillus subtilis subsp.Subtilis str.168的碱性磷酸酶基因序列作为模板设计引物。根据DNA序列和所采用的表达质粒载体pET-28a-c (+)的图谱，用Primer Premier 5.0软件设计了两对引物。在上游引物和下游引物上分别设置BamHⅠ和Hind Ⅲ 的酶切位点，这两个不同的限制性内切酶识别位点分别在引物中以下划线的方式标记出来。引物序列如下:
　　上游引物:
　　5'-CGGGATCCATGAAAAAAATGAGTTTGT-3'(BamHⅠ)
　　下游引物：
　　5'-CCGAAGCTTTTATTTTCCAGTTTTT-3'(Hind Ⅲ)
　　基因扩增
　　以提取的基因组DNA作为反应模板，利用合成的引物对编码ALF的DNA序列进行PCR反应扩增。
　　以上试剂加好后，离心5 s混匀，加20 μL石蜡油覆盖于混合物上，防止PCR过程样品中水分的蒸发。
　　当所有的反应都完成以后，设置PCR仪的温度保持在4℃。反应完毕后各取5μL用1%琼脂糖凝胶电泳检测，基因长度约为1400bp。加样DL2000TM DNA Marker作为电泳Marker。电泳完毕，在凝胶成像系统观察结果并拍照。
　　产物纯化
　　采用DNA纯化试剂盒进行纯化，具体步骤如下:
　　(1)PCR结束后，将反应液从PCR反应管中移至干净的1.5mL Eppendorf 离心管中，加入4倍体积的Binding Buffer混匀。将纯化柱放入收集管中，把混合液转移到柱内，室温放置2 min。
　　(2)12000 r/min 离心1min。
　　(3）倒去收集管中的废液，将纯化柱放入同一个收集管中，加入600μL Washing Solution，12000 r/min离心1 min。
　　(4）重复步骤(3)一次。
　　(5)倒去收集管中的废液，将纯化柱放入同一个收集管中，12000 r/min离心2min。
　　(6)将 3S 柱放入另一1.5 mL离心管中，在纯化柱膜中央加30 μL TE,37℃放置2 min。
　　(7)12000 r/min 离心1 min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃ 备用。
　　注意事项
　　1.PCR反应的灵敏度很高，为了防止污染，使用的0.2 mL的Eppendorf管和吸头都必须是新的、无污染且无酶的，实验操作需戴上一次性手套，操作应尽可能在无菌操作台上进行。
　　⒉.使用工具酶和DNA样品的操作必须在冰浴条件下进行，使用后有剩余的应立即放回冰箱中。
　　3.应设含除模板DNA外所有其他成分的阴性对照。
　　4.引物的使用浓度一般为0.1～1.0 μmol/L，浓度过高易形成引物二聚体或增加非特异性产物;过低则影响效率。
　　5.PCR产物要经电泳鉴定，得到分子大小一致的目的条带后再进行PCR产物的纯化和回收
　　结果分析
　　对PCR产物的DNA凝胶电泳结果进行拍照并分析

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