定植，就是将培植好的种苗移种至适合生长的基质上。铁皮石斛种植的专家们发现，组培苗的根长度生长到1厘米左右时进行移植的成功率是最高的。在进行定植前，要先将铁皮石斛的组培苗放在待移植的室内约4周让它适应新的环境，这叫炼苗。移植前先用清水洗干净组培苗根上的培养杂质，然后用百菌清液消毒，否则组培苗根会腐烂。
进行定植栽培时，要注意保持株行距，15到20厘米是合适的。定植时先在基质上挖深2到3厘米深的小洞，然后轻轻地将经过炼苗、出瓶洗净后的组培苗根部放入小洞，注意不要弄断石斛的肉质根，用基质盖好。要注意使组培苗的根系自然舒展开，将基质完全覆盖住根，轻轻向上提起苗，这样能使苗根系与基质充分接触，浇足营养水。
铁皮石斛是一种丛生植物，所以多株种植比单株种植长势更好，也更容易成活，一般是以3到5株一丛种植。栽培时间的选择上是在每年3到6月份为宜，这时定植组培苗成活率较高，接近百分百，而且生长健壮，定植时的气温过低或过高都不好。在野生铁皮石斛的产地，除了最冷的1到2月和最热的7到8月以外都可以进行定植。
