黑线仓鼠是典型的杂食性动物，但主要食种子，偶尔吃少量的昆虫与植物。黑线仓鼠与其他仓鼠一样繁殖力很强，一窝可以生很多只，每胎平均4～9只幼仔，但以6只居多黑线仓鼠通常在冬天是不繁殖的。
以夜间活动为主，白天隐藏于洞穴内，黎明前、黄昏后活动频繁，一般以19：00～21：00为害严重。春季刨食播下的小麦、玉米、豌豆等种子，继而啃食幼苗，特别喜欢吃豆类幼苗；作物灌浆期啃食穗果，并有跳跃转移为害的特点，啃食水果及瓜类时专挑成熟、甜度大的为害，秋季夜间往洞中盗运成熟的粮食及油料，贮备冬季食料。根据跟踪调查，由于黑线仓鼠为害，一般可使小麦减产12.6%～16.5%，豆类减产9.6%～15.6%，果园减产9.0%。
夜间活动，傍晚至天明有2次活动高峰，以20～22时活动最盛。夏秋比春季和冬季活动频繁，严冬时很少出洞。
气温及降雨量是影响种群数量变动的重要因素。月平均气温在10℃时黑线仓鼠活动较少，15℃时活动日趋频繁，繁殖最适温度20～25℃。5月份的气温高低对秋季发生数量影响较大。如果5月气温高，食料充足，有利于当年出生幼鼠的生长发育，并进行繁殖，到秋季种群数量可大幅度上升。
种群年龄组成有季节变化。
在华北地区，2～3月以成体Ⅱ组占优势，6月以成体I组、亚成体组和幼体组为主，9～10月以亚成体组为主。在东北地区，在开春后的5～6月以幼体占优势，7～8月以亚成体为主，10月至次年3月以成体I组占多数，在3～5月成体Ⅱ组占优势。
种群数量的季节消长极为明显。
一般12月至翌年3月捕获率低，5～6月和9～10月形成2个数量高峰。但在不同地区高峰月份稍有差异。
气温及降雨量是影响种群数量变动的重要因素。
月平均气温在10℃时黑线仓鼠活动较少，15℃时活动日趋频繁，繁殖最适温度20～25℃。5月份的气温高低对秋季发生数量影响较大。如果5月气温高，食料充足，有利于当年出生幼鼠的生长发育，并进行繁殖，到秋季种群数量可大幅度上升。
如山东阳谷县，1984年6月份降雨量达86.8mm，最大日降雨量高达44.3mm，7月份降雨量猛增至155.7mm，因此使9月份黑线仓鼠的种群数量迅速下降。但在内蒙古等比较干旱地区，在多雨的年份，农作物生长良好、牧草丰收，黑线仓鼠往往发生较重。
