多聚酶链式反应扩增DNA片段

　　教学目标：
　　（一）知识与技能
　　1、了解pcr技术的基本操作
　　2、理解pcr的原理
　　3、讨论pcr的应用
　　（二）过程与方法
　　在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源dna污染，严格控制温度等反应条件
　　（三）情感、态度与价值观
　　通过对pcr实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神
　　教学重点：pcr的原理和pcr的基本操作
　　教学难点：pcr的原理
　　教学过程：
　　（一）引入新课
　　在现代生物技术中，dna技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对dna分子碱基序列的分析。而分析dna碱基序列，就需要一定量的dna片段。怎样迅速获得足够量的dna片段呢？今天我们来研究学习dna分子的扩增技术――pcr技术。
　　（二）进行新课
　　1．基础知识
　　pcr技术扩增dna的过程，与细胞内dna复制过程类似：
　　1．1细胞内dna复制条件分析：
　　条件组分作用
　　模板dna的两条单链提供复制的模板
　　原料四种脱氧核苷酸合成dna子链的原料
　　酶解旋酶
　　dna聚合酶打开dna双螺旋
　　催化合成dna子链
　　能量atp为解螺旋和合成子链供能
　　引物rna为dna聚合酶提供合成的3’端起点
　　1．2细胞内dna复制过程
　　（1）dna的反向平行结构：（结合投影图）
　　核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）
　　由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。
　　dna双螺旋结构的反向平行结构：
　　（2）dna的复制过程:
　　解 旋：解旋酶、atp，dna两条链打开，，形成两条dna单链。
　　引物结合：在dna单链3’端与dna反向配对结合，确保引物3’端与dna单链准确配对。
　　dna聚合酶结合：
　　子链合成：dna聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。
　　后续加工：dna聚合酶i将引物切去，并合成空缺处的dna单链，再由dna连接酶将不连续的dna子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）
　　子链合成特点：不能从头合成；合成方向为＂5’ 3’合成＂。
　　感悟生命的神秘：dna聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。rna聚合酶没有校对功能，因此rna的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在rna引物完成功能后即被dna聚合酶i删去，代之以高保真的dna链。
　　［思考］dna分子能准确复制的原因有哪些？
　　dna双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；dna聚合酶的复查功能。
　　［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？rna合成、蛋白质合成。
　　1．3dna分子复制的人工控制
　　解开螺旋：在80 100 时，dna双螺旋打开，形成两条dna单链，称为变性。
　　恢复螺旋：在50 左右时，两条dna单链重新形成双螺旋结构，称为复性。
　　复制条件：缓冲液,dna模板,四种脱氧核苷酸,热稳定dna聚合酶,两种引物。
　　反应场所：pcr仪（自动温度周期性调节）。
　　［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）1．4pcr的反应过程
　　变性：在95 时dna解旋
　　复性：在50 时引物与dna单链结合
　　延伸：在72 时合成dna子链（两个引物间的序列）2．实验操作
　　2．1 pcr反应体系：缓冲液、dna模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定dna聚合酶、两种rna引物，水
　　2．2 实验操作步骤
　　2．3 按照pcr反应体系配方配制反应液；
　　（2）将pcr反应体系50μl用微量移液器转移到微量离心管（0.5ml）中；
　　（3）将微量离心管放到pcr仪中；
　　（4）设置pcr仪的工作参数。
　　（5）dna在pcr仪中大量扩增。
　　2．4 水浴法：将微型离心管依次在95 、55 、72 的恒温水浴锅中循环处理相应时间。
　　3．实验注意事项
　　3．1避免外源dna污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。
　　3．2缓冲液和酶分装成小份，－20 低温保存。
　　3．3每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。
　　3．4混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。
　　4．结果分析与评价
　　4．1反应液稀释：取2µlpcr反应液，添加98µl蒸馏水；2．分光光度计调零：将100µl蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。
　　4．2将100µl反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。
　　4．3计算：dna含量 50 光吸收值 稀释倍数
　　（三）课堂总结、点评
　　（四）实例探究
　　例1 在（ ）的温度范围内，dna的双螺旋结构解开
　　a. 10－20  b. 80－100  c. 20－30  d. 40－60
　　解析：蛋白质大多不能忍受60－80 的高温，而dna在80 以上才会变性。
　　答案：b
　　例2 关于dna的复制，下列叙述正确的是（ ）
　　a.dna聚合酶不能从头开始合成dna，只能从5’端延伸dna链
　　b.dna复制不需要引物
　　c.引物与dna母链通过碱基互补配对进行结合
　　d.dna的合成方向总是从子链的3’端向5’端延伸
　　解析：由于dna聚合酶不能从头开始合成dna，只能从引物的3’端即复制方向由3’端向5’端延伸；由于dna分子是反向平行的，子链是依据碱基互补配对原则，在dna聚合酶作用下合成的，其合成方向是从子链5’端向3’端延伸。
　　答案：c
　　综合应用
　　例3 下列有关pcr描述，不正确的是（ ）
　　a.是一种酶促反应
　　b.引物决定了扩增的特异性
　　c.扩增产量按y （1 x）n
　　d.扩增对象是氨基酸序列
　　e.扩增对象是dna序列
　　解析：pcr是一种体外迅速扩增dna片段的技术，它以极少量的dna为模板，以四种脱氧核苷酸为原理，在引物的作用下使dna聚合酶从引物的3’端连接脱氧核苷酸，短时间内迅速复制上百万份的dna拷贝，其扩增产量为y （1 x）n，y代表dna片段扩增后的拷贝数，x表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数，因此答案选d。
　　答案：d
　　课后探究
　　1、pcr与生物体dna复制有何区别？
　　2、如果在案件侦破过程中，只收集到一根毛发，但它所含的遗传信息太少，该怎么办呢？
　　教后小记
　　教师在教学过程中，可以先引导学生回忆必修2的有关dna复制的知识，在此基础上，学生可加深对于pcr原理的认识。对于pcr反应过程的教学，应以读图识图为主。教材中反应过程图解详细的描绘了参与pcr的各种组成成分；每一轮反应的三个基本步骤—变性、复性、延伸；每一步骤的作用。教师在教学中可以请学生在读图的同时，结合教科书中的文字说明来加深理解。当学生遇到难以理解的地方时，教师要及时给予解答。