一. 本周教学内容： 二.学习内容： 本周学习基因工程的操作过程，指导进行基因工程操作时需要的基本工具：限制酶、连接酶、运载体，了解他们的特点，及其在基因工程中的应用。理解基因工程操作的基本步骤，理解如何提取目的基因，怎样将目的基因导入受体细胞，怎样鉴定试验的成果等等。了解基因工程对现代社会的贡献及基因工程应用的发展。 三. 学习重点： 1. 基因工程的概念 2. 基因工程的操作工具 3. 运载体的基本条件 4. 基因工程的基本操作步骤 5. 基因工程的应用和发展 四. 学习难点： 1. 基因工程工具：限制酶、运载体 2. 运载体的基本要求 3. 基因工程的操作步骤 4. 如何检测基因操作 5. 基因工程应用的两面性 五. 学习过程： （一）概念：基因工程——又叫基因拼接技术或dna重组技术。 是指在生物体外，通过对dna分子进行人工＂剪切＂和＂拼接＂，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。 概念要点： 1. 在dna分子水平上进行设计操作的 2. 在生物体外实现的基因改造 3. 对受体细胞进行无性繁殖 4. 重组基因最终表达获得性状 （二）基因操作的工具 1. 抗虫棉的培育：将抗虫的基因从某种生物（如苏云金芽孢杆菌）中提取出来，＂插入＂到棉花的细胞中，与棉细胞中的dna结合起来，在棉中发挥作用。 2. 技术要点 首先：从苏云金芽孢杆菌的一个dna分子上辨别出所需要的基因，并且把它切割下来 其次：将切割下来的抗虫基因与棉的dna＂缝合＂起来 a. 基因的剪刀——限制性内切酶 全称： dna限制性内切酶（以下简称限制酶）。 来源：主要来自于微生物中（目前已经发现了200多种限制酶） 特点：一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割dna分子 例如：从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别gaattc序列，并在g和a间切开。 补充知识： 1. 限制性内切酶可以水解侵入细菌的外源性dna分子，保护细菌自身 2. 每种限制性内切酶能识别dna中4—6个核苷酸的特殊序列 3. 细菌自身相同序列被修饰（甲基化）而不被水解 4. 限制酶能产生交错切口，形成粘性末端 b. 基因的针线——dna连接酶 黏性末端：被限制酶切开的dna两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫做黏性末端。 dna连接酶：两种来源不同的dna用同一种限制酶来切割，然后让两者的黏性末端通过互补的碱基黏合起来，dna连接酶在断口处把两条dna末端之间的缝隙＂缝合＂起来——形成共价键 c. 基因的运输工具——运载体 作用：要将一个外源基因，送入受体细胞。 条件： ① 能够在宿主细胞中复制并稳定地保存 进行复制、表达 ② 具有多个限制酶切点 以便与外源基因连接 ③ 具有某些标记基因 便于进行筛选 常用运载体：质粒、噬菌体和动植物病毒等。 质粒：是基因工程最常用的运载体，最常用的质粒是大肠杆菌的质粒 存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状dna分子。 特点：① 含有抗性基因：大肠杆菌质粒中常含抗药基因，如：抗四环素的标记基因 ② 基因组很小：细菌质粒的大小只有普通细菌染色体dna的百分之一 ③ 质粒能够＂友好＂地＂借居＂在宿主细胞中。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。 ④ 质粒的复制则只能在宿主细胞内完成。 来源：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌等细菌中都有质粒。（土壤农杆菌很容易感染植物细胞，使细胞生有瘤状物。培育转基因植物时，常常用土壤农杆菌中的质粒做运载体。） 六. 基因操作的基本步骤 （一）取目的基因 目的基因:是人们所需要的特定基因 苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因 植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因 种子的贮藏蛋白的基因 人的胰岛素基因、干扰素基因等 主要途径：① 从供体细胞的dna中直接分离基因 ② 人工合成基因。 1. 直接分离基因:最常用的方法是＂鸟枪法＂，又叫＂散弹射击法＂。 具体操作：供体细胞中的dna 切成许多片段 重组dna 受体细胞（大量复制） 基因扩增 分离含有目的基因的细胞 把带有目的基因的dna片段分离出来 优点：操作简便 缺点： ① 工作量大，具有一定的盲目性 ② 真核细胞的基因含有不表达的dna片段，不能直接用于基因的扩增和表达 主要应用：如许多抗虫、抗病毒的基因都可以用上述方法获得。 2. 人工合成基因： （1）逆转录法 以目的基因转录成的信使rna为模板，反转录成互补的单链dna，然后在酶的作用下合成双链dna，从而获得所需要的基因。 目的基因mrna 单链dna 双链dna（目的基因序列） （2）化学合成法 根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使rna序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因 蛋白质氨基酸序列 mrna序列 dna序列 目的基因 优点：目的性强，比较容易获得真核基因序列 缺点：操作技术性强，不容易获取，基因表达不容易控制 主要应用：如人的血红蛋白基因、胰岛素基因等就可以通过人工合成基因的方法获得。 重要发展：dna序列自动测序仪对提取出来的基因进行核苷酸序列分析，扩增dna技术（也叫pcr技术），使目的基因在短时间内成百万倍地扩增。 a. 目的基因与运载体结合 b. 将目的基因导入受体细胞 常用受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 主要手段：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 质粒 细菌 目的基因扩增 感受态细胞：能够接受外源dna的细胞 将细菌用氯化钙处理，以增大细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒易进入受体细胞。 c. 目的基因的检测和表达 1. 转基因结果： ① 在全部受体细胞中，真正能够摄入重组dna分子的受体细胞很少 ② 重组dna转移成功的受体细胞不一定能够表达 ③ 必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。 2. 检测的方法 （1）抗性监测： （2）性状检测： 受体细胞是否表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。 基因工程的成果与发展前景 一. 基因工程与医药卫生 a. 生产基因工程药品 传统药品生产：直接从生物体的组织、细胞或血液中提取的 原料有限，产品价格昂贵。如：猪胰岛素，紫草素 工程菌生产：通过发酵工程生产 高效率、高质量、低成本的药品。如胰岛素、干扰素和乙肝疫苗等 胰岛素：是治疗糖尿病的特效药。 胰岛素生产传统方法基因工程 来源猪、牛胰腺提取大肠杆菌工程菌分泌 产量4—5克/100千克100克/1000升培养液 比较产量低、价格高、供不应求产量高、工厂化生产、满足患者需要 白细胞介素－2：是淋巴细胞产生的一种淋巴因子 本质：小分子蛋白质（分布于血清中） 功能：能促进淋巴细胞活化和增殖 应用：主要用于治疗肿瘤和感染性疾病 生产：白细胞介素－2在大肠杆菌中的高效表达，发酵工程生产 干扰素：是病毒侵入细胞后产生的一种糖蛋白 本质：可溶性糖蛋白（分布于血清和组织液） 来源：被病毒感染的组织细胞产生（非病毒基因表达产物） 功能： ① 它是一种抗病毒的特效药，对细菌和真菌感染作用不大 ② 几乎能抵抗所有病毒引起的感染，如水痘、肝炎、狂犬病等病毒引起的感染， ③ 干扰素对治疗乳腺癌、骨髓癌、淋巴癌等癌症和某些白血病也有一定疗效。 干扰素生产传统方法基因工程方法 来源从人血液中的白细胞内提取大肠杆菌及酵母菌细胞内获得 产量1mg干扰素/300l血液20 40mg干扰素/1kg细菌培养物 比较基因工程方法生产产量高、效果稳定、成本低，适于工厂化生产 基因工程药物： 蛋白质产品：胰岛素、干扰素外、白细胞介素、溶血栓剂、凝血因子、人造血液代用品等 疫苗产品：预防乙肝、狂犬病、百日咳、霍乱、伤寒、虐疾等疾病的各类疫苗。 b. 用于基因诊断与基因治疗 基因工程技术还可以直接用于基因的诊断和治疗。 1. 基因诊断：用放射性同位素（如32p）、荧光分子等标记的dna分子做探针，利用dna分子杂交原理，鉴定被检测标本上的遗传信息，达到检测疾病的目的。 基本原理：分子杂交 诊断病例： ① 病毒性疾病：利用dna探针可以迅速地检出肝炎患者的肝炎病毒、肠道病毒、单纯疱疹病毒等多种病毒。 ② 诊断遗传性疾病：用β－珠蛋白的dna探针检测出镰刀状细胞贫血症，苯丙氨酸羟化酶基因探针检测出苯丙酮尿症。 ③ 肿瘤诊断中的应用：用白血病患者细胞中分离出的癌基因制备的dna探针，可以用来检测白血病。 2. 基因治疗：把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的 病例试验： 半乳糖血症：常染色体单基因隐性遗传病 病理：乳糖代谢异常 由于细胞内半乳糖苷转移酶基因缺陷而缺少半乳糖苷转移酶，因此当乳糖分解成半乳糖后，不能继续转化为葡萄糖，过多的半乳糖在体内积聚，会引起肝、脑等功能受损 治疗：体外试验水平 用带有半乳糖苷转移酶基因的噬菌体侵染患者的离体组织细胞，结果发现这些组织细胞能够利用半乳糖了 结论：用基因替换的方法治疗这种遗传病是可能的 基因治疗并非对致病基因进行修复 该种治疗方法并不能稳定遗传 二.基因工程与农牧业、食品工业 1. 主要应用：培育高产、优质或具有特殊用途的动植物新品种。 （1）通过基因工程技术获得高产、稳产和具有优良品质的农作物。 如：用基因工程的方法可以改善粮食作物的蛋白质含量。 实验：将菜豆储存蛋白的基因转移到向日葵中，培育出了＂向日葵豆＂植株 前景：如果以此作为技术基础，把大豆蛋白的基因转移到水稻、小麦等粮食作物中，就可以提高这些作物的蛋白质含量，改善它们的品质。 （2）用基因工程的方法培育出具有各种抗逆性的作物新品种。 原理：抗性基因转移到作物体内，将从根本上改变作物的特性。 如抗虫、抗病毒、抗除草剂、抗盐碱、抗干旱、抗高温等（自然界中细菌身上几乎可以找到植物所需要的各种抗性） 例如：抗虫的烟草、番茄、马铃薯、玉米、大豆、油菜、棉等作物，抗黄瓜花叶病毒、苜蓿花叶病毒的作物，以及抗除草剂的植物等 （3）基因工程在畜牧养殖业上的应用： 病毒dna 实验前景： ① 特殊动物： 将人生长素基因和牛生长素基因分别注射到小白鼠的受精卵，得到体型巨大的＂超级小鼠＂ ② 乳房反应器 利用某些特定的外源基因在哺乳动物体内的表达，从这些动物的乳腺细胞中获得人类所需要的各类物质，如激素、抗体及酶类等。 ③ 开辟新的食物来源 可以用基因工程的方法从微生物中获得人们所需要的糖类、脂肪和维生素等产品。 三.基因工程与环境保护 1. 用于环境监测——用dna探针可以检测饮用水中病毒的含量 方法：使用一个特定的dna片段制成探针，与被检测的病毒dna杂交，从而把病毒检测出来 特点：快速、灵敏 （用传统方法进行检测，一次需要耗费几天或几个星期的时间，精确度也不高。用dna探针只需要花费一天的时间，并且能够大幅度地提高检测精度，据报道，1t水中有10个病毒也能检测出来。） 2. 用于被污染环境的净化——工程菌分解环境污染物 ＂超级细菌＂： 把能分解三种烃类的基因都转移到能分解另一种烃类的假单孢杆菌内，创造出了能同时分解四种烃类的＂超级细菌＂ 假单胞杆菌：异养需氧型 【模拟试题】 一. 判断题 1. 重组dna技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和运载体。（ ） 2. 限制酶的切口一定是gaattc碱基序列。（ ） 3. 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列。（ ） 4. 目的基因是指重组dna质粒。（ ） 5. 只要检测出受体细胞中含有目的基因，那么，目的基因一定能成功地进行表达。（ ） 6. 基因治疗主要是对有缺陷的细胞进行修复。（ ） 7. 基因工程在农业上的应用主要是培育高产、稳产、品质优良和具有抗性的农作物。（ ） 8. 用基因工程方法培育的抗虫植物也能够抗病毒。（ ） 9. 基因工程在畜牧业上应用的主要目的是培育体型巨大、品质优良的动物。（ ） 10. 任何一种假单孢杆菌都能分解四种石油成分，因此，假单孢杆菌是＂超级细菌＂。 （ ） 二. 选择题 1. 1971年，科学家在体外做实验，将带有半乳糖苷转移酶基因的噬菌体侵染半乳糖血症患者（半乳糖苷转移酶基因缺陷）的离体组织细胞，结果发现这些组织细胞能产生半乳糖苷转移酶，恢复了将半乳糖转化为葡萄糖的能力，从而能利用半乳糖能量。该材料说明（ ） a. 半乳糖血症为显性遗传病，会导致体内半乳糖积聚，进而导致肝伤害 b. 噬菌体自身携带有半乳糖苷转移酶基因，能合成半乳糖苷酶 c. 实验展示了基因治疗的前景，表明能对缺陷基因进行修复达到治疗疾病的目的 d. 人类已经能定位并且分离出半乳糖转移酶基因，可以通过基因探针进行基因诊断 2. 关于基因工程的叙述正确的是（ ） a. 限制酶只有在获得目的基因时才用 b. 重组质粒的形成是在细胞内完成 c. 质粒都可以作为运载体 d. 蛋白质结构分析可为目的基因的合成提供材料 3. 苯丙氨酸羟化酶基因探针可以用来检测苯丙酮尿症，其基本原理是（ ） a. 利用苯丙氨酸羟化酶催化反应来检测酮尿症症状 b. 利用苯丙氨酸羟化酶基因测序确定是否患苯丙酮尿症 c. 通过标记的dna探针分子与苯丙氨酸羟化酶基因分子杂交检测确定 d. 通过标记的dna探针分子与苯丙氨酸羟化酶rna分子杂交检测确定 4. 关于运载体的描述中正确的是（ ） a. 运载体的物质本质是蛋白质，能够在不同的细胞间转移基因 b. 运载体主要存在于细胞膜上，完成膜两侧的信息交流和物质转运功能 c. 运载体是核酸分子，能够与基因重组完成携带转移、遗传信息的作用 d. 运载体可以是动植物病毒，主要完成蛋白质转运功能 5. 基因工程操作是在哪个水平上完成的（ ） a. 染色体水平 b. 细胞水平 c. 转录水平 d. dna分子水平 三. 简答题 1. β－珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的功能不正常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀型细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β－珠蛋白，想一想，应如何进行设计？ 2. 基因工程对人类产生的影响都是有益的吗？为什么？ 3. 下图是将人的生长素基因导入到细菌m内制造＂工程菌＂示意图，所用载体质粒a，已知细菌m内不含质粒a，也不含质粒a上的基因，质粒a导入细菌m后，其上的基因能得到表达。则： （1）人工合成目的基因的途径一般有那两条？写出其过程。 （2）在分子遗传学上c被称为_____________，其特点是________________________。 如何根据通过a、b来构建c，请写出简要过程。 （3）通常用cacl2处理m，完成导入过程，其原因是什么？导入过程的效率是很低的，只有少数的m才能称为工程菌，请问如何选择可用于工业发酵生产的工程菌菌株。 （4）工程菌成功表达的标志是什么？ 4. 利用基因工程生产蛋白质药物，经历了三个发展阶段。第一阶段，将人的基因转入细菌细胞；第二阶段，将人的基因转入小鼠等动物的细胞。前两个阶段都是进行细胞培养，提取药物。第三阶段，将人的基因转入活的动物体，饲养这些动物，从乳汁或尿液中提取药物。 （1）将人的基因转入异种生物的细胞或个体内，能够产生药物蛋白的原理是基因能控制 。 （2）人的基因能和异种生物的基因拼接在一起，是因为它们的分子都具有双螺旋结构，都是由四种 构成，基因中碱基配对的规律都是 。 （3）人的基因在异种生物细胞中表达成蛋白质时，需要经过 和翻译两个步骤。在翻译中需要的模板是 ，原料是氨基酸，直接能源是atp，搬运工兼装配工是 ，将氨基酸的肽键连接成蛋白质的场所是 ，＂翻译＂可理解为将由 个＂字母＂组成的核酸＂语言＂翻译成由 个＂字母＂组成的蛋白质＂语言＂，从整体来看 在翻译中充任着＂译员＂。 （4）利用转基因牛、羊乳汁提取药物工艺简单，甚至可直接饮用治病。如果将药物蛋白基因移到动物如牛、羊的膀胱上皮细胞中，利用转基因牛羊尿液提取药物比乳汁提取药物的更大优越性在于：处于 动物都可生产药物。 5. 科学家通过基因工程培育抗虫棉时，需要从苏云金芽孢杆菌中提取出抗虫基因，＂放入＂棉花的细胞中与棉花的dna结合起来并发挥作用，请回答下列有关问题： （1）从苏云金芽孢杆菌中切割抗虫基因所用的工具是 ，此工具主要存在于 中，其特点是 。 （2）苏云金芽孢秆菌一个dna分子上有许多基因，获得抗虫基因常采用的方法是＂鸟枪法＂。具体做法是：用 酶将苏云金芽孢杆菌的 切成许多片段，然后将这些片段 ，再通过 转入不同的受体细胞，让它们在各个受体细胞中大量 ，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把 分离出来。 （3）进行基因操作一般要经过的四个步骤是 、 、 、 。 [参考答案] 1. 运载体不是酶，是dna分子 2. 不同的限制酶有不同的识别位点，切割位点也各不相同 3.
4. 目的基因是自然界中存在的各种基因，为人类所要利用的基因 5. 目的基因转移成功不一定能够表达，表达是一个受调控的复杂过程 6. 基因治疗是一种补偿性治疗，对原来的基因没有做修复处理 7.
8. 不同的目的基因功能不同，抗虫基因和抗病毒基因不是同一基因 9. 转基因动物主要是培育能产生特定蛋白质的动物 10. 一般假单孢菌子只能分解一种烃 二. 选择题： 1. d 2. d 3. c 4. c 5. d 三. 简答题： 1. 提取目的基因、目的基因与运载体结合、目的基因导入受体细胞、对目的基因检测 2. 基因工程的应用不一定都是好的： （1）安全性问题：对人体是否真正安全 （2）生态环境问题：转基因生物会不会导致生态平衡被破坏 （3）大众能否接受：混淆了传统意义上的界限，如动物蛋白和植物蛋白等 （4）社会伦理道德问题：克隆生物（人）的认可问题 3.（1）① 逆转录法：利用提取的目的基因的mrna逆转录出单链dna，然后合成双链dna分子，获得目的基因；② 人工化学合成法：通过分析蛋白质的氨基酸序列，根据遗传密码子，推导出mrna的碱基序列，根据碱基互补配对原则，推导出目的基因的碱基序列，通过化学方法合成。 （2）重组dna分子（重组质粒）；质粒上含有目的基因；用同一种限制性内切酶分别切割a、b，使a、b具有同一种粘性末端，将a、b以适当比例混合，利用dna连接酶使形成重组质粒c （3）cacl2处理使细胞壁的通透性变大，外源dna更容易进入细菌。 利用添加青霉素的选择培养基培养转到细菌，如果长出菌落，表明该菌落细菌具有青霉素抗性，为转导成功菌株，携带人生长素基因，可作为工业生产用的工程菌。 （4）能够分泌人生长素 4.（1）蛋白质的合成 （2）脱氧核苷酸；a对t、g对c （3）转录；mrna；trna；核糖体；多个；3个；trna （4）不同发育时期的 5. （1）限制性内切酶；微生物；只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割dna分子 （2）限制性内切；dna分子；分别载入运载体；运载体；复制；目的基因 （3）提取目的基因；目的基因与运载体结合；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与表达