MACS2作为使用最广泛的peak calling软件，在v2版本中添加了差异peak分析的功能，所有的子命令功能描述如下
通过bdgdiff子命令来进行差异peak分析， 该命令不需要基于已有的peak calling结果，只需要输入每个样本对应的bedGraph格式的文件。需要注意的是，该命令只针对两个样本间的差异peak进行设计，适用于没有生物学重复的情况。
对于使用macs2来进行差异peak的完整流程，官方给出了详细的说明文档，链接如下
https://github.com/taoliu/MACS/wiki/Call-differential-binding-events
可以分为以下3步
1. 预测插入片段长度
通过predictd子命令可以预测样本的fragment size，命令如下
macs2 predictd -i input.bam
2. peak calling
在peak calling时，需要添加-B参数，这样才可以输出样本对应的bedgraph文件，同时需要保证peak calling时采用一致的--extsize的值，就是第一步预测出来的数值，取多个样本的均值即可。官方也给出了推荐值，对于大多数的转录因子chip_seq数据，推荐值为200， 对于大部分组蛋白修饰的chip_seq数据，推荐值为147，命令如下
# condition1
macs2 callpeak -B -t cond1_ChIP.bam -c cond1_Control.bam -n cond1 --nomodel --extsize 120
# condition2
macs2 callpeak -B -t cond1_ChIP.bam -c cond1_Control.bam -n cond1 --nomodel --extsize 120
在运行这一步的时候，会输出每个样本过滤之后的reads数目，示意如下
# tags after filtering in treatment: 19291269
# tags after filtering in control: 12914669
这个数值在差异分析中会用到，所以要记录下来。
3. 差异peak分析
命令如下
macs2 bdgdiff --t1 cond1_treat_pileup.bdg --c1 cond1_control_lambda.bdg --t2 cond2_treat_pileup.bdg
--c2 cond2_control_lambda.bdg --d1 12914669 --d2 14444786 -g 60 -l 120 --o-prefix diff_c1_vs_c2
其中-d1和-d2的值就是第二步运行时输出的reads数目，-o参数指定输出文件的前缀。运行成功后，会产生3个文件
diff_c1_vs_c2_c3.0_cond1.bed
diff_c1_vs_c2_c3.0_cond2.bed
diff_c1_vs_c2_c3.0_common.bed
其中, con1.bed保存了在condition1中上调的peak, con2.bed保存了在condition2中上调的peak, common.bed文件中保存的是没有达到阈值的，非显著差异peak。
上述3个文件格式是完全相同的，最后一列的内容为log10 likehood ratio值，用来衡量两个条件之间的差异，默认阈值为3，大于阈值的peak为组间差异显著的peak, 这个阈值可以通过-c参数进行调整。
·end·
