Cas13酶沿着RNA行走的景象。
图片来源：纽约基因组中心
基于CRISPR的遗传筛选已帮助科学家鉴定了镰状细胞贫血，癌症免疫疗法，肺癌转移以及许多其他疾病的关键基因。但是，这些基因筛选的范围有限：它们只能编辑或靶向DNA。对于人类基因组的许多区域，靶向DNA可能无效，而其他生物（例如冠状病毒或流感之类的RNA病毒）也无法通过现有的DNA靶向CRISPR筛选完全靶向。
现在，科学界的一个重要的新资源今天发表在《Nature Biotechnology》杂志上，纽约基因组中心和纽约大学的Neville Sanjana博士实验室的研究人员开发了一种新的靶向RNA的CRISPR筛选技术。
研究人员利用了最近发现的一种名为Cas13的CRISPR酶，该酶靶向RNA而不是DNA。利用Cas13，他们设计了一个优化的平台，用于在人类细胞的RNA水平上进行大规模平行的基因筛选。这种筛选技术可以用于了解RNA调控的许多方面，并识别非编码RNA的功能，非编码RNA是产生的RNA分子，但不编码蛋白质。
通过针对人类RNA转录物中成千上万个不同的位点，研究人员开发了一种基于机器学习的预测模型，以加速识别最有效的Cas13指导RNA。研究人员可以通过交互式网站和开源工具箱使用这项新技术，以预测定制RNA靶标的指导RNA效率，并为所有人类蛋白质编码基因提供预先设计的指导RNA。
这项研究的作者Sanjana博士说：“我们预计靶向RNA的Cas13酶将对分子生物学和医学应用产生重大影响，但是我们对于高靶向效力的指导RNA设计知之甚少。” “我们打算通过深入而系统的研究来改变这一点，以开发出最有效的指南设计的关键原理和预测模型。”
Sanjana博士是纽约基因组中心的核心教员，纽约大学生物学助理教授，纽约大学医学院神经科学与生理学助理教授。
Cas13酶是VI型CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）酶，最近被鉴定为可设计的RNA指导的RNA靶向蛋白，具有核酸酶活性，可在不改变基因组的情况下实现靶基因敲低。这种特性使Cas13成为一种潜在的重要治疗手段，可以在不永久改变基因组序列的情况下影响基因表达。
“这是我们在纽约基因组中心培育和开发的技术创新。这项来自Sanjana实验室的最新CRISPR技术对推进基因组学和精准医疗领域具有令人兴奋的意义。” ，纽约基因组中心Evnin家庭科学总监兼首席执行官Tom Maniatis博士说。
博士后科学家Hans-Hermann Wessels和该研究的共同一作、博士生Alejandro Méndez-Mancilla开发了一套新的基于Cas13的工具，并在哺乳动物细胞中进行了转录平铺和排列筛选。研究人员总共收集了超过24,000个RNA靶向引导的信息。
Wessels博士说：“我们在许多不同的转录本中加入了引导RNA，其中包括几个人类基因，我们可以通过抗体染色和流式细胞术轻松地检测转录本的敲低。” “在此过程中，我们发现了一些有趣的生物学发现，这可能会扩大靶向RNA的Cas13酶的应用。”
例如，研究小组的发现向导RNA的哪些区域对于识别靶RNA更为重要。他们使用成千上万个与它们的靶RNA具有1、2或3个碱基错配的引导RNA，确定了一个关键的“种子”区域，该区域对CRISPR引导与靶之间的错配非常敏感。这一发现将有助于科学家设计指导性RNA，以避免非目标RNA上的脱靶活性。由于典型的人类细胞表达约100,000个RNA，因此，准确定位Cas13的预定靶点对于筛选和治疗应用至关重要。
除了进一步了解Cas13脱靶外，“种子”区域还可以用于下一代生物传感器，从而可以更精确地区分密切相关的RNA物种。总体而言，这项研究将以前的Cas13研究在哺乳动物细胞中的数据点数量增加了两个数量级以上。
共同第一作者Méndez-Mancilla说：“使用优化的Cas13筛选系统靶向非编码RNA令我们特别兴奋。” “这极大地扩展了CRISPR工具箱，用于正向遗传和转录组筛选。” 在这项研究中，研究人员注意到以信使RNA的不同蛋白质编码和非编码元件为靶标时，蛋白质敲除存在显着差异，并发现参与转录物加工和剪接的Cas13与其他RNA结合蛋白竞争的证据。
该团队最近利用他们的指导RNA预测模型进行了特别关键的分析：COVID-19突发公共卫生事件是由于冠状病毒引起的，该冠状病毒包含RNA（而非DNA）基因组。使用从大规模平行筛选中得出的模型，研究人员确定了最佳指导RNA，可用于未来检测和治疗应用。
文献来源:
Wessels, H., Méndez-Mancilla, A., Guo, X. et al. Massively parallel Cas13 screens reveal principles for guide RNA design. Nat Biotechnol (2020). doi.org/10.1038/s41587-020-0456-9
https://www.nature.com/articles/s41587-020-0456-9
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