今天，我将为大家解读一篇3.96分的SCI，借此来学习GEO数据库甲基化芯片发SCI的套路，文章的题目是：Aberrantly methylated-diferentially expressed genes and pathways in colorectal cancer。
首先简单介绍一下，GEO数据库(GENE EXPRESSION OMNIBUS)是NCBI旗下主打基因表达芯片的数据库，它的网址是http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo，或者直接通过PUBMED的菜单栏进入。
小硕在此申明，GEO数据库的芯片数据是不花钱的！而且数据海量，更新较快！小伙伴们迫不及待了吧,Let´s go!
1、摘要
全文思路明确，从GEO数据库中下载4张芯片，其中2张基因表达芯片(GSE68468, GSE44076)和2张甲基化的芯片(GSE29490, GSE17648)，是不是感觉芯片在手，天下我有？
接着利用GEO2R工具找出甲基化的差异基因(methylated-DEGs)，DAVID网站做功能和富集分析，STRING网站做蛋白互作网络图(PPI)，利用Cytoscape软件的MCODEapp构建PPI聚类功能模块。
最终，找出了异常甲基化的差异表达基因和通路，这些Hub基因可能作为异常甲基化的生物标志物，以此服务于结肠癌的精准治疗。
2、芯片数据下载及预处理
“Totally 186 CRC and 55normal mucosa specimens were enrolled in GSE68468 (platform: GPL96 AfymetrixHuman Genome U133A Array) while 98 CRC and 50 normal mucosa specimens wereenrolled in GSE44076 (platform: GPL13667 Afym[1]etrix Human Genome U219 Array).”这句来源于原文中，咋一看，不了解GEO的小伙伴可能有点懵，一会GSE,一会GPL?请看下面表格内容。
总结一下，GEO数据库的表达谱信息主要储存在DataSets和Profiles中，而数据下载说到底就是要得到表达矩阵，即“基因在行，样本在列”的矩阵。
在下图的GEO DataSets输入研究的癌症，然后就可以选择自己需要的芯片，里面关于芯片的信息非常详细，下载原始文件，整理后即可得到需要的表达矩阵。哈哈，还是挺容易实现的。
3、数据处理
利用GEO数据库自带的GEO2R工具将样本分为正常组和病例组，设定cut-off值(P < 0.05and |t| > 2),寻找出差异表达基因(DEGs)和差异甲基化基因(DMGs)。
再利用EXCEL中的MATCH函数进行匹配，去除重叠的基因，同时获得甲基化芯片和表达谱芯片的交集，最终得到低甲基化-高表达基因411个，高甲基化-低表达基因239个，利用R软件代码实现韦恩图制作，文中的韦恩图确实不错哈。
选取典型的芯片的TOP100基因(包括50高表达和50低表达基因)做差异基因的热图，可通过R代码实现热图的制作。微信公众号回复“热图”，可获得R软件热图制作代码。
4、GO功能富集分析
DAVID网站(网址https://david.ncifcrf.gov/)实现GO功能富集分析，这个还是比较简单的，直接上图了。分别从生物学过程(BP)，细胞组成(CC)，分子功能(MF)对低甲基化-高表达基因、高甲基化-低表达基因功能注释，选取排名前5的富集分析制成下表。
5、KEGG通路分析
同样，利用DAVID网站进行KEGG通路分析，分别预测了低甲基化-高表达基因、高甲基化-低表达基因富集的通路。
6、PPI网络构建、模块分析和Hub基因选择
蛋白互作网络图(PPI)通过STRING网站来制作(网址https://string-db.org/)，PPI聚类功能模块则用Cytoscape软件的MCODEapp制作。其中PPI网络图，以Interactionscore＞0.4作为cut-off值；利用Cytoscape软件，筛选出MCODE评分＞3、节点数＞4的PPI网络中的模块制作聚类模块分析图。筛选出节点degree大于10的即为Hub基因。
最终分别筛选出低甲基化-高表达基因排名前五的Hub基因：CAD,CCND1, ATM, RB1 and MET；高甲基化-低表达基因排名前五的Hub基因：EGFR,ACTA1, SST, ESR1 and DNM2。
7、Hub基因在TCGA数据库中验证
分别将低甲基化-高表达的Hub基因和高甲基化-低表达的Hub基因在TCGA中观察Hub基因的甲基化状态和表达差异，最终结果如下表，大部分Hub基因在TCGA中和GEO数据库中的甲基化状态和表达差异是一致的，这对作者的GEO数据库分析加强了说服力。
综上，可以看出本文甲基化数据挖掘步骤：
(1)GEO芯片下载和预处理：GEO数据库直接下载原始数据；R软件的GEOquery包(上bioconductor官网搜索)。预处理一般就是将原始文件整理成我们需要的表达矩阵。
(2)差异基因和甲基化基因的筛选：本文采用的是GEO在线工具GEO2R分组后设定cut-off值P < 0.05and |t| > 2，分别可以筛选出高、低表达基因，高、低甲基化基因，利用EXCEL中的MATCH函数去除重叠的基因，同时对低甲基化高表达的基因求交集，对高甲基化低表达基因求交集。制作韦恩图，选取典型芯片做热图。当然，这一步也可以用R软件跑，最终结果是一致的。
(3)GO和KEGG分析：DAVID网站直接实现。
(4)PPI网络构建、模块分析和Hub基因选择：STRING网站做蛋白互作网络图，利用Cytoscape软件的MCOD app构建PPI聚类功能模块。通过cut-off值设定，节点degree大于10的即为Hub基因。
(5)TCGA数据库验证：利用TCGA数据库分析Hub基因的甲基化状态和表达差异，看是否与GEO数据库一致，以增强说服力。
做到这里，已经3.96分了，小硕设想，如果继续把Hub基因进行共表达或预后分析，是不是影响因子又得上涨呢！当然，前面这些步骤都不用花经费！假如你的老板经费充足，继续来个小样本的实验验证吧，估计小伙伴们手已痒痒，赶紧准备发文吧！我们明天将手把手教你R语言实操分析GEO数据库甲基化芯片。
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