铜绿假单胞菌可在选择培养基上培养并产生绿脓色素的即可鉴定为铜绿假单胞菌，若无色素或在鉴别培养基上不发酵乳糖或葡萄糖的革兰阴性杆菌，可行以下方法进一步鉴别。
1.色素鉴定：可将细菌接种于King A、B斜面培养基，37℃ 24h或置室温观察5天。
(1)绿脓色素：在King A斜面上呈深绿色，液体培养基接触空气处绿色明显。若色素不明显或混杂其他色素，可加氯仿于斜面，置室温观察1～24h，如仍不明显，可在氯仿液中滴加稀盐酸，绿脓色素在酸液层呈红色。
(2)绿脓荧光色素：铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌在King B斜面培养基上呈现黄绿色荧光。
(3)红脓色素：在King A斜面培养基上呈红紫色，如置37℃ 24h红色不明显，可再置室温3～5天观察。铜绿假单胞菌产生红脓毒素者较少见。
(4)黑脓毒素：铜绿假单胞菌在含蛋白胨培养基中生长时常有黑脓毒素产生。嗜麦芽窄食单胞菌也有黑脓毒素产生。
2.其他鉴定：绿脓杆菌和其他假单胞菌的主要鉴别是葡萄糖氧化分解、氧化酶、精氨酸双水解、乙酰胺酶、葡萄糖酸氧化、硝酸盐还原产氨试验均为阳性。绿脓杆菌败血症患者尿中出现铜绿色蛋白尿，将患者尿液调成酸性、碱性和中性，置于暗室分别用紫外线照射，如有铜绿蛋白尿则发生淡绿色荧光。
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