教学目标: (一)知识与技能 1、了解pcr技术的基本操作 2、理解pcr的原理 3、讨论pcr的应用 (二)过程与方法 在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中,应避免外源dna污染,严格控制温度等反应条件 (三)情感、态度与价值观 通过对pcr实验的操作及结果分析,培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神 教学重点:pcr的原理和pcr的基本操作 教学难点:pcr的原理 教学过程: (一)引入新课 在现代生物技术中,dna技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对dna分子碱基序列的分析。而分析dna碱基序列,就需要一定量的dna片段。怎样迅速获得足够量的dna片段呢?今天我们来研究学习dna分子的扩增技术――pcr技术。 (二)进行新课 1.基础知识 pcr技术扩增dna的过程,与细胞内dna复制过程类似: 1.1细胞内dna复制条件分析: 条件组分作用 模板dna的两条单链提供复制的模板 原料四种脱氧核苷酸合成dna子链的原料 酶解旋酶 dna聚合酶打开dna双螺旋 催化合成dna子链 能量atp为解螺旋和合成子链供能 引物rna为dna聚合酶提供合成的3’端起点 1.2细胞内dna复制过程 (1)dna的反向平行结构:(结合投影图) 核苷酸分子的结构与方向性:(分子结构模式图) 由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链:(模式图,体现方向性)。 dna双螺旋结构的反向平行结构: (2)dna的复制过程: 解 旋:解旋酶、atp,dna两条链打开,,形成两条dna单链。 引物结合:在dna单链3’端与dna反向配对结合,确保引物3’端与dna单链准确配对。 dna聚合酶结合: 子链合成:dna聚合酶从引物3’端开始,将配对的脱氧核苷酸连接起来。 后续加工:dna聚合酶i将引物切去,并合成空缺处的dna单链,再由dna连接酶将不连续的dna子链连接起来(半不连续合成。先导链,滞后链) 子链合成特点:不能从头合成;合成方向为"5’ 3’合成"。 感悟生命的神秘:dna聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成,还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次,只有碱基配对无误后才能继续往下聚合,它不能从头合成。rna聚合酶没有校对功能,因此rna的合成不需要引物,而是从头合成的,它的错配可能性较大,在rna引物完成功能后即被dna聚合酶i删去,代之以高保真的dna链。 [思考]dna分子能准确复制的原因有哪些? dna双螺旋结构提供模板;碱基互补配对;dna聚合酶的复查功能。 [思考]细胞内哪些物质是从头合成的?rna合成、蛋白质合成。 1.3dna分子复制的人工控制 解开螺旋:在80 100 时,dna双螺旋打开,形成两条dna单链,称为变性。 恢复螺旋:在50 左右时,两条dna单链重新形成双螺旋结构,称为复性。 复制条件:缓冲液,dna模板,四种脱氧核苷酸,热稳定dna聚合酶,两种引物。 反应场所:pcr仪(自动温度周期性调节)。 [思考]缓冲液相当细胞内的什么成分?(核基质)1.4pcr的反应过程 变性:在95 时dna解旋 复性:在50 时引物与dna单链结合 延伸:在72 时合成dna子链(两个引物间的序列)2.实验操作 2.1 pcr反应体系:缓冲液、dna模板,四种脱氧核苷酸原料、热稳定dna聚合酶、两种rna引物,水 2.2 实验操作步骤 2.3 按照pcr反应体系配方配制反应液; (2)将pcr反应体系50μl用微量移液器转移到微量离心管(0.5ml)中; (3)将微量离心管放到pcr仪中; (4)设置pcr仪的工作参数。 (5)dna在pcr仪中大量扩增。 2.4 水浴法:将微型离心管依次在95 、55 、72 的恒温水浴锅中循环处理相应时间。 3.实验注意事项 3.1避免外源dna污染:所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。 3.2缓冲液和酶分装成小份,-20 低温保存。 3.3每添加一种反应成分,更换一个移液器的枪头。 3.4混匀后离心处理,使反应液集中在离心管底部。 4.结果分析与评价 4.1反应液稀释:取2µlpcr反应液,添加98µl蒸馏水;2.分光光度计调零:将100µl蒸馏水添加到比色杯中,在260nm处将分光光度计调整读数为零。 4.2将100µl反应稀释液倒入比色杯中,测定在260nm处的光吸收值。 4.3计算:dna含量 50 光吸收值 稀释倍数 (三)课堂总结、点评 (四)实例探究 例1 在( )的温度范围内,dna的双螺旋结构解开 a. 10-20 b. 80-100 c. 20-30 d. 40-60 解析:蛋白质大多不能忍受60-80 的高温,而dna在80 以上才会变性。 答案:b 例2 关于dna的复制,下列叙述正确的是( ) a.dna聚合酶不能从头开始合成dna,只能从5’端延伸dna链 b.dna复制不需要引物 c.引物与dna母链通过碱基互补配对进行结合 d.dna的合成方向总是从子链的3’端向5’端延伸 解析:由于dna聚合酶不能从头开始合成dna,只能从引物的3’端即复制方向由3’端向5’端延伸;由于dna分子是反向平行的,子链是依据碱基互补配对原则,在dna聚合酶作用下合成的,其合成方向是从子链5’端向3’端延伸。 答案:c 综合应用 例3 下列有关pcr描述,不正确的是( ) a.是一种酶促反应 b.引物决定了扩增的特异性 c.扩增产量按y (1 x)n d.扩增对象是氨基酸序列 e.扩增对象是dna序列 解析:pcr是一种体外迅速扩增dna片段的技术,它以极少量的dna为模板,以四种脱氧核苷酸为原理,在引物的作用下使dna聚合酶从引物的3’端连接脱氧核苷酸,短时间内迅速复制上百万份的dna拷贝,其扩增产量为y (1 x)n,y代表dna片段扩增后的拷贝数,x表示平均每次的扩增效率,n代表循环次数,因此答案选d。 答案:d 课后探究 1、pcr与生物体dna复制有何区别? 2、如果在案件侦破过程中,只收集到一根毛发,但它所含的遗传信息太少,该怎么办呢? 教后小记 教师在教学过程中,可以先引导学生回忆必修2的有关dna复制的知识,在此基础上,学生可加深对于pcr原理的认识。对于pcr反应过程的教学,应以读图识图为主。教材中反应过程图解详细的描绘了参与pcr的各种组成成分;每一轮反应的三个基本步骤—变性、复性、延伸;每一步骤的作用。教师在教学中可以请学生在读图的同时,结合教科书中的文字说明来加深理解。当学生遇到难以理解的地方时,教师要及时给予解答。