师妹
师兄恭喜！你终于博士毕业了！CNS都不在话下，太崇拜了，秘诀是什么呀？
多看paper，勤做实验，总结经验。
师兄
师妹
paper我看得不少，细胞总是养不好……
其实养细胞没那么难，你就当养自己的孩子一样就好了～师兄这就把呕心沥血整理的细胞培养终极秘籍交给你，望你刻苦学习，代代相传，实验室的下一轮CNS就靠你了！
师兄
师妹欣喜地拿到了师兄的细胞培养秘籍，迫不及待地打开，一阵金光徐徐展开……（请粉丝们自行脑补）
既然养细胞=养孩子（也可比拟为养你心爱的宠物），那么就要全方位精心呵护，细胞培养（养孩子）是生命科学研究（人生）的核心部分，培养技术（养孩子技术）也在不断发展。
正确地优化工作流程、遵循实验室最佳操作实践、掌握全面的细胞培养技巧是获得一致性实验结果和加速科研发现的关键（是把孩子培养成才的关键）。
树立孩子三观：你到底是谁——细胞身份验证
据估计，现在使用的细胞株大约有15-20%已经不是人们认为的细胞。2004年的一篇报告指出生命科学领域在细胞来源和细胞株身份鉴定检测方面普遍缺乏警惕。在440名受访者中，超过三分之一的人从其他实验室获取细胞株，且几乎半数没有进行身份检测。造成细胞身份错误的原因包括不同细胞株的交叉污染和标签错误，而正确和定期的进行细胞身份验证是避免这种问题的关键。
目前常用的细胞身份验证的方式包括：
1) STR分型：基于多重PCR、同时扩增基因组中多态STR位点的技术鉴定人类和小鼠细胞系；
2) DNA条码：基于PCR和测序的CO1条码分析技术鉴定非人类细胞系；
3) 全基因组测序：能够鉴定种间和种内污染
培养技巧
不分享或非正式渠道购买细胞系，坚持身份验证和正式文档；
保持细胞系来源的详细记录，包括使用的细胞类型、来源和试剂批号；培养物图片；遗传修饰或重编程方法；
保存组织样品用于原产地后续确认，如果细胞源于某种疾病，也需要保存样品进行为组织病理学，以及保存正常组织样品用于比较；
至少每年一次进行细胞验证，理想情况是6个月一次。
给孩子一个家：汽相氮vs液相氮——细胞冻存
细胞冻存是细胞实验不可或缺的环节，比如购买的细胞株、构建的细胞系、细胞传代等都需要进行冻存备份。选择优质的冻存试剂、合适的冷冻技术和冻存容器是获得理想的细胞冻存结果的基本条件。
液氮储存
优势
劣势
液相储存
温度低，响应存储问题的时间较长
污染风险高；储存瓶破裂/爆炸风险高
汽相储存
污染风险低
响应存储问题的时间较短
培养技巧
完整、明确的标记冻存瓶/管；
尽可能在最低的传代次数冻存样品；
使用合适的冷冻技术，有些细胞（如干细胞）喜欢超速冷冻，但大部分都需要慢速冷却；
液体vs.汽相氮存储：推荐汽相氮储存以降低污染风险；
在多个位置储存重要的保存物，并在冻存后不久取出一管评估细胞活力。
孩子要怎么保护：无菌过滤技术——培养准备
成功的细胞培养需要适当的无菌技术。无论培养物上漂浮的细菌污染团是什么，都说明你需要过滤除菌来解决了。过滤装置的选择很多，通常需要根据不同的应用目的来选择合适的滤膜材质和孔径。
应用
推荐膜材质
推荐孔径
培养基过滤
PES (流速快)
PVDF(低蛋白吸附)
0.45 μm(去除颗粒物，澄清，非无菌)
0.22 μm(去除大部分微生物，无菌)
支原体去除
PES
0.1 μm(细胞大小约0.15-0.3 µm范围)
培养技巧
膜的选择通常要考虑样本特点、组成和体积。被过滤样本的溶质和溶解分子或粒子必须与滤膜化学兼容；
样品搅拌和调整单位过滤面积的流量可以提高产量和有助于防止颗粒在膜表面聚集；
净化和粗滤最好使用0.45μm大小孔径来完成；
大多数培养基和缓冲液的快速过滤使用0.45μm孔径大小的PES膜；
灭菌含血清和其他蛋白的培养基使用0.22μm孔径大小的PES膜；
去除支原体使用0.10μm孔径大小的PES膜；
极低蛋白结合和含高价值生物分子的无菌溶液使用0.22μm孔径大小的PVDF膜。
惨！孩子生病了：令人头疼的支原体——细胞污染
细胞培养过程中的污染问题是普遍存在的，包括细菌、病毒、化学污染等。Merten的一项研究发现普通细胞株的病毒污染事件超过25%，而FDA、ATCC及其他诸多研究表明，大约5-30%的细胞培养存在支原体污染。
支原体可以通过改变细胞代谢、引起染色体畸变、延缓细胞生长和干扰细胞附着而显著影响细胞培养物。然而，支原体污染很难被检测到：不具有细胞壁, 在相差显微镜下不可见；其灵活的形态和0.15-0.3µm范围的细胞大小可以助其逃脱标准的细胞培养过滤方法(0.22 µm孔径滤膜)；培养物中支原体滴度可达到108个/ml而不引起培养基浑浊。
培养法
赫斯特染色
高效的PCR法
培养技巧
使用Mycoplasma Erase试剂清洁和去除实验室表面和器具的支原体污染，包括清洁桌椅、工作台、培养箱、细胞储存盒、液氮容器等；
使用0.1 µm或更小孔径的滤膜过滤培养基和缓冲液；
定期使用特定的支原体检测方法进行筛查，培养法、DNA染色法、PCR法等；
支原体在相邻的污染细胞培养物具有高度传染性，发现后应及时用LookOut支原体消除试剂去除。
孩子到了青春期咋办：胰酶的使用——细胞消化
细胞分离的方法通常分为酶学方法如使用胶原酶、胰蛋白酶、Accumax™、Accutase等，以及非酶学消化液如EDTA、NO-ZYME™、Non-enzymatic消化液等。其中，胰蛋白酶是实验室中通常的用于贴壁细胞消化的酶。
胰蛋白酶适用于许多细胞类型，但根据应用和细胞类型的不同，通常使用不同的组分和浓度：
EDTA：粘附分子在钙离子存在时决定细胞-细胞和细胞-基质的互作，为了削弱互作联系，通常使用含EDTA的胰蛋白酶螯合二价阳离子(货号：T4049)。
酚红：pH指示剂。胰蛋白酶在pH 7-9范围内具有最佳活性，如果环境条件使胰蛋白酶pH变酸性(呈现橘色)会导致酶活下降。使用NaOH调整pH至7.4-7.6可优化胰蛋白酶活性。
稀释液：浓缩的胰蛋白酶通常使用缓冲液如Hanks平衡盐溶液(货号：H9394)进行溶解或稀释，从而维持pH和渗透压平衡。
来源和形式：胰蛋白酶的主要来源是猪，可以是冻干粉或溶液。为了避免动物或微生物物质，也可以在玉米中重组表达胰蛋白酶。
浓度：高浓度胰蛋白酶长期孵育会去除细胞表面蛋白而损伤细胞，甚至杀死细胞。根据不同的细胞类型和浓度，胰蛋白酶的使用浓度有很大差别。对于强贴壁细胞系，常使用0.25%-2.5%的胰蛋白酶。如果研究目的需要细胞表面蛋白的完整性，则应降低使用浓度(0.05%胰蛋白酶)
要想长得好，营养不可少：血清的选择——细胞生长
胎牛血清(FBS)由于包含丰富的营养成分，被广泛作为细胞培养剂补充物，细胞提供综合营养、激素、生长和附着因子，用于促进和维持脊椎动物、哺乳动物和昆虫细胞的生长。血清还可作为细胞培养系统的缓冲液，避免各种因素（包括pH变化、蛋白水解活性或重金属、内毒等）干扰细胞生长或产生毒性作用。
血清质量是成功细胞培养的关键。然而，市面上FBS的来源地很多，质量良莠不齐，因此在选择和使用血清时要格外注意。
培养技巧
澳大利亚来源的FBS被公认为是品质更优、更安全的血清；
选择可靠的供应商，确保血清品质；
批量购买或挑选检测结果相近的批次，尽可能确保批间一致性；
选择血清时注意查看指标和检测结果，包括过滤工艺、无菌处理、微生物检测、内毒素、血红蛋白等。
是驴子是马总归要拉出来遛的：计数的重要性——细胞分析
监测和量化细胞健康和功能是获得有生物学意义数据的必要条件。为了快速高效的确定细胞状态，可以通过：监测细胞大小以获得更多关于细胞健康和分化状态的信息；经常计数细胞以检查你的细胞培养物状况。
一款基于库尔特原理的细胞计数器可同时满足快速高效进行细胞计数和细胞大小测定的双重需求，库尔特原理是最精确的细胞计数方法， 基于库尔特原理的细胞计数器生成的数据不仅提供精确的细胞计数,还显示平均细胞大小和群体分布信息。使用库尔特细胞计数器的另一好处是可以获得细胞群体大小分布的直方图，显示样品的单分散程度。
培养技巧
确保计数的细胞是混合均匀的，否则会由于细胞密度的局部差异导致计数有误。
转移细胞样品可能引入错误，在细胞培养罩内使用手持式自动细胞计数器是避免可变性、获得培养物精确信息的最佳方式。
准备样品时检测仪器规格，确保细胞直径和起始稀释度与计数方法兼容。
Q
A
&
以上细胞培养技巧(养孩子技巧)你都get到了吗？能不能成为细胞的合格“父母”，现在就来测一下吧👇。
向上滑动，查看所有测试题
Q1：培养污染是普遍存在的，病毒是较难检测的污染物之一。下述那种方法可以最有效防止病毒污染？
A 增加提取细胞的生物来源
B 从未发现病毒污染的隔壁实验室获得细胞株
C 从进行病毒检测和提供相关认证的资源库获得细胞株
D 只在线订购五星好评的细胞株
Q2：造成细胞生长不良的原因很多，包括使用劣质的储存物、使用不正确的冻融方法等。为防止冰晶形成，推荐的冷冻速率大约是？
A 每分钟1-3°C
B 每分钟5-10°C
C 每小时1-3°C
D 每小时5-10°C
Q3：排除细胞污染因素后，沉淀往往是造成培养物混浊的罪魁祸首。引起沉淀的最常见原因是？
A 温度变化
B 钙盐
C 金属补充物
D 以上均是
Q4：贴壁细胞附着不佳是细胞传代的常见问题。下述因素不会妨碍细胞附着的是？
A 培养箱温度波动
C 培养箱气体混合物
D 细胞污染
Q5：导致悬浮细胞凝结的原因很多，包括组织崩解不完全。在从组织制备单细胞悬液时，哪种酶被经常用于消化细胞外基质？
A 脱氢酶
B 胶原酶
C DNA酶
D 漆酶
Q6：当从培养箱中拿出培养皿时没人愿意看到死亡的细胞，下述不属于引起健康培养物中细胞死亡的常见原因是？
A 细胞传代次数不够
B 培养箱温度波动
C 微生物污染
D 细胞毒性自由基的存在
Q7：细胞系错误鉴定在研究中很普遍，防止交叉污染对获得可行信的培养细胞实验结果至关重要。目前使用的细胞系大约有多少可能是错误鉴定的？
A 1-3%
B 5-10%
C 15-20%
D 25-40%
Q8：要去除大部分微生物污染，可选择的最大滤器孔径是？
A 0.1 μm
B 0.22 μm
C 0.45 μm
D 0.05 μm
Q9：当培养基和缓冲液泄露时，细胞培养物会受到污染。下述不属于引起无菌液体污染的常见原因是？
A 选择错误孔径的滤膜装置
B 过滤后未能正确处理或密封培养基瓶盖
C 在生物安全柜中采用适当的无菌技术
D 重复使用无菌膜或膜装置
Q10：血清属于生物提取物，实验室使用的血清产品对微生物检测指标有严格的要求。下述处理可帮助排除微生物污染的是？
A 0.22 μm过滤
B 0.1 μm三级过滤
C γ辐照处理
D 以上均是
记下你的答案了吗?
正确答案要来了哦👇～
Q1正确答案C：为了防止细胞培养的病毒污染，应该选择对病毒不敏感的动物，并限制提取细胞的生物来源。从进行病毒检测和无病毒认证的可靠资源库获得细胞株。
Q2正确答案A：使用液氮冷冻细胞时需要按照细胞供应商的推荐方法进行。但一般情况下，冷冻应该缓慢进行，大约1-3°C每分钟的速率可以尽可能减少冰晶的形成。
Q3正确答案D ：温度变化是引起培养基沉淀的常见原因，因为极端温度会导致盐和蛋白聚集并析出。引起沉淀的因素还包括失水诱导的浓度变化、钙化合物脱盐、金属补充物等，每种原因都有其特异的解决方案。
Q4正确答案B ：培养平面用细胞外基质（包括胶原、纤连蛋白、层黏连蛋白）蛋白处理可以帮助贴壁表型细胞附着。
Q5正确答案B：胶原是细胞外基质的丰富成分，胶原酶具有使胶原变性的独特能力。当从组织制备单细胞悬液时，通常需要消化基质。
Q6正确答案A：导致健康培养物中细胞死亡的原因很多，包括细胞传代次数太多，不一致或不合适的培养箱、微生物污染、细胞融合度太高等。
Q7正确答案C：目前使用的细胞系预计15-20%不再是我们认为的细胞。从可靠的细胞银行资源库获得细胞、进行验证检测、使用专用的培养基/试剂/物料、保持独立的主细胞和工作细胞储存液是解决细胞系错误识别和交叉污染问题的几种有效方法。
Q8正确答案B：0.22 μm膜孔径可去除常见的污染物如酵母、大部分细菌、哺乳动物细胞和花粉。0.1 μm孔径可用于去除支原体。
Q9正确答案C：在生物安全柜中采用适当的无菌技术可以保护培养物免受污染。
Q10正确答案D：0.22 μm膜孔径可去除常见的污染物如酵母、大部分细菌、哺乳动物细胞和花粉；0.1 μm孔径可用于去除支原体；25-40 kGy剂量的γ辐照处理，可使血清被微生物污染的可能性降低10倍至1亿倍(Log Reduction>1~>8)。
测试完毕，以上共计10题，满分100分，能不能成为细胞的“100%父母”自己检测一下吧～
菜鸟型“父母”：答对1-3题：
培养失败，为人“父母”，基础的知识尚且缺乏，细胞已经瑟瑟发抖，请你高抬贵手。
成长型“父母”：答对4-6题：
你离及格仅有一步之遥，继续努力还有希望，以上文章请仔细再读100遍，你的细胞小可爱们期待你及格回归。
优质型“父母”：答对7-9题：
你的细胞在生长，但不茁壮，以上文章请再看50遍，细胞小可爱们的成功近在咫尺。
大神“父母”：答对10题：
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